生物结构解析平台

生物结构解析平台围绕多尺度结构解析技术为生物分子、亚细胞、细胞等的结构生物学研究提供支撑。平台具有X射线晶体衍射技术、核磁共振技术、冷冻电镜单颗粒技术、冷冻电子断层成像技术等多尺度结构解析手段，为多种生物样品提供从原子分辨率、近原子分辨率、亚纳米及纳米尺度的结构信息。

生物结构解析平台配置先进的大型仪器设备共计20台套，涵盖从样品制备到高分辨率成像及三维重构的全链条技术支撑。核心设备包括2台300kV冷冻透射电镜（Thermo Scientific Krios G4），配备Falcon 4i直接电子探测相机及SelectrisX能量过滤器，可实现单颗粒分析与冷冻电子断层数据的稳定采集，支持原子分辨率（通常优于3 Å）结构解析。1台200kV冷冻透射电镜（Glacios 2）用于快速冷冻样品筛选，并适用于纳米脂质颗粒、外泌体、膜囊泡等生物大分子的高分辨率成像。此外，平台配备的120kV透射电镜支持负染样品及常温超薄切片样品的快速形貌鉴定。

在原位结构解析方面，平台配置2台冷冻聚焦离子束扫描电镜（Aquilos 2）与1台冷冻聚焦等离子束扫描电镜（Helios 5 Hydra CX），专用于细胞、组织及器官等大体积生物样品的原位减薄，可制备厚度为100–150 nm的冷冻薄片，为冷冻电子断层成像提供适配样品。配套的冷冻制样系统包括投入式冷冻仪、高压冷冻仪及等离子清洗仪，保障样品在近生理状态下实现玻璃化冷冻。

数据处理与分析方面，平台部署Amira三维图像处理软件，支持电子断层数据的自动化分割、三维渲染及视频生成，助力复杂生物结构的可视化阐释。

除冷冻电镜技术体系外，平台还集成高辉度X射线单晶衍射仪、蛋白稳定性分析仪及全自动液体处理工作站，实现从晶体筛选、衍射数据收集到结构解析的全流程支持，进一步拓展了平台在结构生物学与药物研发中的多维度分析能力。已建成全流程技术能力6项，列表如下（表5.1）。

表5.1 生物结构解析平台全流程服务项目列表

平台自投入运营以来，累计为33个课题组提供技术支持，培训用户超过200人次，支撑多项科研项目取得突破。平台提供全流程技术服务，主要包括：

1）快速投入式冷冻样品制备

此项服务旨在将生物样品迅速冷冻至玻璃态冰状态，以保留其天然水合状态和精细结构，避免冰晶损伤。平台使用Vitrobot Mark IV、EM GP2等冷冻投入式制样机，将纯化后的蛋白复合物、病毒或亚细胞组分等液体样品定量加载到特定的载网（如铜网或金网）上。通过控制环境的温度与湿度，利用快速投入式冷冻仪将载网迅速浸入液氮冷却的制冷剂液态乙烷中。这一过程（通常在毫秒级完成）使样品中的水分子来不及形成结晶而直接固化，为后续高分辨率冷冻电镜观察提供了高质量的原始样品。该技术是冷冻电镜分析的前提和基础，确保待观察的生物分子接近生理状态。

2）冷冻透射电镜分析（单颗粒样品）

该服务利用300kV 冷冻透射电镜（Thermo Scientific Krios G4）对玻璃化冷冻的样品进行高分辨率数据采集。技术流程包括：

高通量数据采集：利用电镜配备的Falcon 4i直接电子探测相机和SelectrisX能量过滤器，对均匀分布于载网孔内的生物大分子颗粒进行自动化、高通量的图像采集。能量过滤器通过去除非弹性散射电子，显著提升图像的衬度和信噪比。

原子分辨率结构解析：采集到的数万至数百万张包含不同颗粒取向的二维投影图，通过复杂的图像处理算法进行颗粒挑选、二维分类、三维重构，最终获得密度图。

模型搭建：基于高分辨率密度图（通常优于3 Å，可达原子分辨率），平台技术人员可协助用户搭建和优化生物大分子的原子模型，精确揭示蛋白质及其复合物的三维空间结构、功能域构象以及相互作用的分子机制。

3）冷冻透射电镜分析（电子断层扫描样品）

此服务专注于原位结构生物学研究，对细胞、组织或大分子复合物进行三维结构解析。依托300kV冷冻透射电镜，平台提供冷冻电子断层成像（Cryo-ET）技术服务：

倾斜系列数据采集：针对利用冷冻聚焦离子束扫描电镜（FIB/SEM）制备的厚度约为100–300 nm的冷冻薄片（Lamella），在电镜下进行一系列倾转角度（如从-60°到+60°）的成像，采集一组不同角度的投影图（即倾斜系列）。

三维重构与断层图重建：利用软件对倾斜系列图像进行对齐和三维重构，生成包含丰富结构信息的断层图（Tomogram）。

可视化与子断层平均：断层图中包含了细胞内的复杂环境，如细胞骨架、细胞器互作、原位蛋白复合物等。平台可结合Amira等三维图像处理软件，对目标结构进行自动化或手动的三维分割、渲染，并通过子断层平均技术对具有多个拷贝的原位蛋白复合物进行高分辨率结构解析，从而在近原子分辨率水平上理解生物大分子在细胞内的真实排布与功能状态。

4）纳米脂质颗粒、外泌体、囊泡、纳米晶颗粒样品表征

该服务面向粒径较小的生物纳米材料，主要利用200kV冷冻透射电镜（Glacios 2）或300kV电镜进行快速且高分辨率的形貌表征：

快速筛选与成像：针对纳米脂质颗粒、外泌体、膜囊泡等样品，200kV电镜提供了高效的质量筛选通道。这些样品通常无需追求原子级的解析度，但需要清晰观察其粒径大小、分布均一性、形态完整性以及多层结构等关键特征。

高衬度成像：利用冷冻电镜的冷冻技术，可以直接观察这些溶液状态下的样品，避免了传统负染技术可能带来的形变和假象。同时，对于纳米晶颗粒，该技术可以直观地观察其晶格条纹、形貌以及可能的团聚状态，为药物递送系统、外泌体生物学及纳米材料科学提供直观的结构证据。

5）常温透射电镜分析

此项服务主要针对无需在冷冻状态下观察的生物样品，利用120kV常温透射电镜（Talos L120C）进行快速形貌鉴定。应用场景包括：

负染样品观察：对纯化后的蛋白复合物、病毒颗粒或细胞器进行负染色处理，通过重金属盐的包埋来反衬出样品的形貌和轮廓。这是一种快速评估样品纯度、均一性和初步结构的有效手段，常用于冷冻电镜样品制备前的质量筛查。

常温超薄切片观察：对经过化学固定、树脂包埋和常温切片机切片的组织或细胞样品进行观察。这主要用于细胞生物学研究，观察细胞内的超微结构，如线粒体、内质网形态、细胞连接以及病理状态下的细胞变化等。

6）一站式X射线衍射结构解析

依托高辉度单晶X射线衍射仪（Rigaku Synergy FRX），平台提供从晶体到原子结构的全链条服务：

晶体筛选与优化：结合全自动液体处理工作站和蛋白稳定性分析仪，平台可辅助用户进行蛋白质的结晶条件筛选和优化。蛋白稳定性分析仪用于评估不同溶液环境中蛋白质的单分散性和热稳定性，为结晶筛选提供依据。

衍射数据收集与处理：将生长良好的蛋白质晶体上机，利用高辉度X射线源收集高分辨率的衍射数据。

结构解析与精修：通过专业的软件套件，对衍射数据进行指标化、积分、合并，并利用分子置换或重原子法解析相位，最终搭建和精修出蛋白质的原子分辨率三维结构。这一技术与冷冻电镜技术互补，尤其适用于那些易于结晶且需要原子级别精确构象的蛋白或小分子药物靶点研究。

综上所述，该六项服务构建了一个从纳米颗粒表征到原子分辨率模型搭建，从体外纯化样品到细胞内原位结构的全维度、一体化生物结构解析平台。